Analyse

Histoire de l’analyse de l’ADN

Au XXème siècle, un chercheur, Alec Jeffreys et un biochimiste Richard Flavel se mettent en tête d’isoler un gène. C'est-à-dire le séparer physiquement du reste de l’ADN. Seulement cela peut être comparé à rechercher une « aiguille dans une botte de foin ». Ils utilisent l’invention d’Edward Southern, le Southern Blot, soit: le transfert de southern. Le but est de détecter la présence de séquences d'ADN spécifiques dans un mélange, en transférant des fragments séparés dans un gel sur une membrane susceptible de subir le traitement d’hybridation, c’est à dire d’associer un brin d’ADN artificiel synthétisé (une sonde) auquel on aura marqué une base grâce à des composés radioactifs, fluorescents ou un anticorps à l’ADN en des points définis. Cela permet de localiser la séquence d'ADN qui nous intéresse. Les deux chercheurs élaborent une sorte d’aimant moléculaire qui s’accroche à un gène spécifique. L’aiguille est toujours dans la botte de foin, mais on peut désormais essayer de retrouver l’aimant. Ils réussissent l’expérience et établissent la première carte génétique localisant un gène de mammifère.

Cela les amène à la découverte des introns, des  portions de l’ADN qui ne contiennent pas d’information pour la synthèse protéique, dont la signification nous échappe. Jusqu’en 1977, on croit encore que l’ADN n’est formé que d’une suite ininterrompue de gène, cependant lorsqu’en 1990 commence le projet génome humain où l’on prévoit de séquencer entièrement un génome, on se rend compte que les gènes ne représentent que 2% de l’ADN on parle selon une des estimations les plus récentes d’environ 3000 gènes. De plus la diversité ne se trouve pas dans les gènes mais entre les gènes: en effet les gènes ne peuvent se permettre de variations sous peine d’altérer le bon fonctionnement de cette machine si bien rodée, des mutations pourraient créer des maladies génétiques graves, comme la mucoviscidose. Mais si cette mutation se fait entre les gènes cela n’aura aucune interaction à par le fait de rendre l’individu unique.

Quelques années plus tard Jeffreys et Flavel arrivent deuxième à l’identification des RFLP (restriction fragment lenght polymorphisme, polymorphisme de taille des fragments de restriction). Il s’agit de molécules contenues dans des bactéries qui ont la capacité de digérer l‘ADN en le coupant en petits morceaux. Ces molécules sont appelées enzymes de restriction et fonctionnent comme des ciseaux moléculaires qui repèrent un morceau d’ADN bien précis et le sectionnent. Par exemple, si l’on prend l’enzyme de restriction EcoRI qui reconnait une séquence particulière de six nucléotides : GAATTC, si on le met en présence d’ADN de séquence de base AAGAATTCAAA, l’enzyme effectuera une césure donnant deux fragments : AAG et AATTCAAA. Mais si un seul nucléotide est différent comme pour AATAATTCAAA la césure ne se fera pas. Chaque enzyme de restriction reconnait une séquence particulière, grâce à eux on peut obtenir plusieurs morceaux de différentes longueurs. Un échantillon d’ADN soumis à ces enzymes produit par conséquent un nombre bien défini de fragments de longueurs précises.

Jeffreys fait la découverte des VNTR (variable number tandem reapeats) aussi appelées minisatellites, des régions du génome ou une même séquence de nucléotides supérieure à 10 nucléotides se répète. Le nombre de ces répétitions est variable d'un individu à l'autre, chaque fragment de longueur différente est appelé « allèle», et pour chaque séquence répétée il existe environ une dizaine d’allèles caractérisés par le nombre de répétition de la séquence. Ces différences sont appelées polymorphisme de répétition. Des études récentes considèrent que nous aurions 1 500 zones de ce type, soit 1 500 systèmes de polymorphisme. Il existe aussi les microsatellites (ou STR, Short Tandem Repeat) qui sont des répétitions de motifs dinucléotidique tri ou tétranucléotidique, par exemple ATATATAT soit (AT)n et n variable entre différents individus ou CAGACAGACAGA soit (CAGA)n. Ceux-ci peuvent être repérés par RFLP en utilisant des enzymes sectionnant le génome mais jamais au sain des minisatellites. Les fragments sont ensuite comparés selon leur taille, qui est due au nombre de répétition des motifs. 

En résumé, l’ADN pourrait être comparé à une longue phrase composé, de passages ayant un sens, de répétions d’un même groupe de lettre plus ou moins long, et de suites de lettres paraissant sans cohérence, soit : bjsqkuuzeydlqh maître corbeau sur un arbre perché jxsdsgueguegueguegueguegueguedbmcsidiuc belle marquise vos beaux yeux me font mourir d’amour atttctctctcatttctctctcatttctctctcatttctctctcxgsgitztixvqytzdioqav.

Jeffreys décide de faire une nouvelle expérience : il prend des échantillons d’ADN de Jenny Foxon et des membres de sa famille et les découpe grâce aux enzymes de restriction, ces morceaux sont ensuite séparés par électrophorèse puis transférés sur une membrane spéciale, c’est la technique du southern blotting. Il crée ensuite une nouvelle sonde conçue pour repérer plusieurs minisatellites en s’accrochant par complémentarité à la séquence de nucléotide qui leur est commune. Il met ces échantillons en contact avec cette sonde radioactive, qui se lie à un fragment autant de fois qu’il présentera la séquence en question. Une photo aux rayons x fait apparaître plusieurs bandes sombres alignées tel un code barre. A chaque bande correspond un fragment de taille différente, un fragment qui contient un nombre différent de répétitions du minisatellite. Et ces minisatellites sont distribués de façon unique. Chaque membre de l famille Foxon possède un tracé différent. Et ce n’est pas tout, les minisatellites passent des parents aux enfants suivant les lois mendéliennes. Celles-ci montrent que lorsque les parent comportent un caractère différent, un seul de ces deux caractère sera visible chez leur enfant, cependant lorsque les descendants sont croisés entre eux, le caractère « perdu » peut refaire surface, de là vient l’appellation de caractère dominant et de caractère récessif.

Les techniques d’identification

Pour l’instant la technique la plus utilisée pour analyser les échantillons biologiques dans le domaine des sciences criminelles est celle de Southern dite aussi RFLP (restriction fragment length polymorphism). Elle consiste à comparer plusieurs échantillons d’ADN en utilisant les mêmes enzymes de restriction et en étudiant les différentes césures qui en résultent. Attention, il est essentiel de comprendre que « l’empreinte génétique » d’un individu ne présente en aucun cas le patrimoine génétique de cette personne. Les techniques d’analyses ne portent que sur des portions spécifiques de l’ADN connues comme ayant d’importantes capacités identificatrices.

Les enzymes de restriction :

Après extraction de l’ADN, on le fragmente avec les enzymes de restriction. Les enzymes de restrictions sont des molécules qui se trouvent dans les bactéries et qui peuvent être comparés à des ciseaux moléculaires. Ils repèrent une suite de nucléotide qui leur est propre, une séquence de base appelé site de restriction et le sépare du reste de la molécule. Toute modification du site de restriction même minime empêche l’action de l’enzyme.

L’électrophorèse :

Ensuite on utilise la technique d’électrophorèse afin de séparer les différents fragments obtenus. Cette technique peut être comparée à celle de la chromatographie où les éléments migrent suivant leur solubilité avec le solvant, dans le cas de l’électrophorèse on utilise un courant électrique. Les fragments sont séparés selon leur taille sur le gel d’agarose traversé par un courant électrique. En effet l’ADN est chargé négativement, ce qui fait qu’en présence de courant, il va migrer de la borne négative à la borne positive. De plus, on peut dire que les bases azotées sont globalement réparties de façon homogène, la masse des fragments d’ADN ne varient donc pas en fonction de leur composition. On peut en déduire que le seul facteur influençant l’électrophorèse est le nombre de bases constituant le fragment, et par conséquent sa taille. Or on a vu que les enzymes coupent l’ADN en des zones spécifiques, si les deux individus sont une seule et même personne, les fragments doivent être similaires et donc de même taille. Ceux-ci migrent plus ou moins vite et loin, plus les fragments sont petits, plus ils migreront loin et inversement, les plus grands migreront le moins loin.

                                                                                                                                              
L’ADN est alors coloré avec du bromure d’éthidium, un agent intercalant mutagène et la coloration est révélée grâce aux UV (254 nm).

Lors d’enquête les résultats doivent être conservés un certain temps et même parfois plusieurs années. Or les colorants utilisés pour visualiser l’ADN ont une durée de visualisation d’environ une semaine. C’est pourquoi on utilise une autre technique celle de l’autoradiographie.

Une super animation: http://www.ac-creteil.fr/biotechnologies/doc_southernblotting.htm

L’autoradiographie :

Après migration des fragments d’ADN dans le gel d’agarose on le plonge dans une solution basique qui va dénaturer l’ADN en ADN mono brin par traitement alcalin. Puis on le plonge dans une solution saline où l’on appose une membrane de nitrocellulose ou de nylon, recouvert de papier absorbant sur le gel. Les fragments d’ADN simples brins sont transférés sur la membrane par capillarité et des liaisons covalentes entre les deux éléments sont formées grâce à la chaleur de l’exposition aux UV. Puis la membrane qui est désormais une réplique parfaite du gel d’agarose est placée dans le milieu d’hybridation, une solution qui contient des sondes radioactives, des brins d’ADN artificiel synthétisés auquel on a ajouté une base azotée qui leurs permet de se fixer à l’ADN associé à un composé radioactif.
L’hybridation correspond à l’association spécifique des sondes et des fragments d'ADN. Lorsque l’on place sur la membrane un film photographique la radioactivité va imprégner le film et y laisser des traces noires donnant un résultat permanent à ceux fragiles de l’électrophorèse.

Deux sortes de sonde sont utilisées par les laboratoires :

---- Les sondes multilocus mises au point par Jeffreys. Celles-ci sont capables de détecter de nombreux fragments d'ADN simultanément chez un individu et la fréquence de bandes communes entre des individus, d'où la qualification d'empreintes génétiques. Il faut définir avec précision la taille des bandes pour pouvoir identifier les individus. Ces sondes exigent une grande quantité d'échantillons biologiques contenant une proportion importante d'ADN. La probabilité d'identification dépend du nombre de bandes détectées sur les autoradiographies. Ce type d'analyse est plus fiable dans les recherches de paternité.L’image obtenue est appelée carte génétique ou « carte de restriction » d’une molécule d’ADN.

---- Les sondes monolocus, quant à elles, sont plus adaptées pour l'identification en criminalistique. Ici les minisatellites sont visualisés sur un seul site à la fois, représenté par un ou deux allèles selon que le sujet est homozygote ou hétérozygote. Moins discriminatives que les sondes multilocus, elles montrent en échange des images parfaitement nettes.

Que ce soit avec les sondes multilocus ou monolocus la durée de l'identification par la méthode du polymorphisme de restriction est considérable : 3 semaines environ pour un multilocus et 8 à 10 semaines avec une sonde monolocus; la quantité de matériel à manipuler est substantielle et la qualité de l'ADN doit être remarquable. Cette technique ne peut donc être utilisée pour tous les types d'échantillons. En effet, sur les lieux du crime on retrouve parfois très peu d'échantillons biologiques ou du matériel contenant une quantité minime d'ADN. La PCR vient donc contrer ces limites matérielles et permet de procéder à l'identification.

Désormais après extraction, les systèmes d’analyse sont le plus souvent automatisés grâce à des appareils produits par des sociétés de biotechnologie comme

Applied Biosystems, Orchid Bioscience ou encore Perkin express. Le résultat n’est plus obtenu sous forme d’image sur film photographique mais sous forme de graphique. Pour chaque marqueur s’affichent un ou deux pics, selon que l’individu soit homozygote ou hétérozygote pour ce locus, ceux-ci correspondent aux différents allèles. Chaque pic est une courbe gaussienne ( une courbe en cloche représentant une équation cartésienne) dont l’aire est proportionnelle au poids moléculaire de chaque forme allélique. Le pic est automatiquement traduit en valeur numérique. On obtient alors un tableau, ou deux nombres sont associés à chaque marqueur. Ce tableau est interprété par des logiciels spécialisés.

Les différents systèmes de marqueurs :

Tous les pays n’utilisent pas les mêmes systèmes de marqueurs. Par exemple le système Britannique le « Seconde Génération Multiplex Plus » (SGM+) en comporte dix alors qu’ils sont au nombre de treize pour celui américain qui reste le plus rependu à ce jour. En France l’article 38 du code pénal de procédure pénale fait la liste des segments d’ADN sur lesquels portent les analyses destinées à l’identification génétique.

D3S1358 (chromosome 3);   VWA (chromosome 12);D8S1179 (chromosome 8); D2S11 (chromosome 21); D18S51 (chromosome 18); D18S51 (chromosome 18); TH01 (chromosome 11); FGA (chromosome 4); T16S539 (chromosome 16); D5S818 (chromosome 5); D13S317 (chromosome 13); D7S820 (chromosome 7); CFS1PO (chromosome 5); TPOX (chromosome 2); Amélogénine (chromosome X ET Y)

Les analyses portent également sur deux au moins des quatre segments d’AND suivants:

D2S1338 (chromosome 2) ; D19S433 (chromosome 19) ; Penta E (chromosome 15) ; Penta D (chromosome 21) ; ainsi que: SE33 (ACTBP2) (chromosome 6).

Les marqueurs sont choisis en fonction de leur pouvoir discriminant. Les analyses se portent donc sur des segments d’ADN qui présentent plusieurs variations alléliques. Chaque marqueur a ces caractéristiques. Par exemple le HumDC4 qui est un marqueur STR présentant dix variations différentes. La séquence qui lui est spécifique est TTTTC. Cette séquence est répétée de cinq à quatorze fois, suivant des dispositions précises.

Allèle5 (TTTTC)5

Allèle 6 (TTTTC)6

Allèle 7 (TTTTC)7

Allèle 8 (TTTTC)8

Allèle 9 (TTTTC)3 CTTTTC (TTTTC)5

Allèle 9 (2) (TTTTC)9

Allèle 10 (TTTTC)3 CTTTTC (TTTTC)6

Allèle 11 (TTTTC)3 CTTTTC (TTTTC)7

Allèle 12 (TTTTC)3 CTTTTC (TTTTC)8

Allèle 14 (TTTTC)3 CTTTTC (TTTTC)10

Comme pour l’allèle 9, il existe parfois deux formes pour le même nombre de répétitions. Il n’existe pas non plus  de normes concernant les probabilités déterminantes, utilisées pour déterminer la probabilité qu’un individu non apparenté au suspect puisse en comporter des caractéristiques similaires. Prenons par exemple celle du système CODIS, cette probabilité est de 1*5.753*10^13 alors que celle dans le cas du FNAEG, elle est de 1*1.01*10^8.