L’ADN extrait et purifié obtenu des étapes précédentes est en bien trop petite quantité pour pouvoir être analysé. C’est là donc qu’entre la PCR (Polymerase Chain Reaction» ou ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase) en action.
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| Kari Mullis acceptant le prix nobel |
La PCR est une technique de biologie moléculaire mise au point en 1985 par Karry Mullis.
La PCR, véritable révolution dans le domaine génétique, va permettre de sélectionner et d’amplifier (recopier) une séquence d’ADN cible.
Ainsi notre ADN inutilisable pourra être amplifié : cela nous procurent ainsi des brins d'ADN répliqués et exploitables.
Auparavant, une telle opération nécessitait impérativement le clonage de la séquence, son isolement, son amplification dans une cellule hôte et sa purification. Cette méthode extrêmement lourde et longue a été dès que possible abandonnée au profit de la PCR qui a certainement connu le développement le plus spectaculaire et le plus rapide dans l'histoire de la biologie.
En effet, moins de 3 ans après sa les au point, l’ensemble des laboratoires de biologie moléculaire l’utilisaient.
On comprend son succès quand l’on voit que cette technique de réplication in vitro permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie. L'ordre de grandeur à retenir est celui du million de copies en quelques heures !
Bénéfices de la PCR :
La PCR a ouvert une nouvelle voie dans le diagnostic médical. Parmi les nombreuses applications majeures de la PCR, l’archéologie, la criminologie, les tests de paternité et la recherche biologique. L’une de ses applications les plus impressionnantes dans le domaine de la recherche est certainement dans le cadre du décryptage du Génome Humain, où elle a contribué à cataloguer la totalité des gènes contenus dans nos chromosomes. La PCR est en mesure de diagnostiquer toute pathologie ou anomalie caractérisée par la présence d’un ADN étranger ou muté. Grâce à la PCR, les laboratoires peuvent désormais produire, en une seule journée de travail, des quantités détectables d’ADN à partir de spécimens ne renfermant seulement qu’une à dix copies d’un virus ou d’une bactérie.
Si l’on prend l’exemple de l’infection à VIH, un diagnostic rapide est crucial pour limiter la propagation de l’infection et débuter un traitement. Avant la PCR, les méthodes standard ne permettaient de déterminer l’infection à VIH que 2 à 3 mois après l’exposition au virus. Pendant tout ce temps, le patient ne bénéficie d’aucun traitement et peut involontairement contaminer d’autres personnes. La capacité de typage (ou classification) des tissus qui caractérise la PCR devrait s’avérer particulièrement précieuse pour les transplantations d’organes et de moelle osseuse, en permettant le meilleur appariement possible entre donneurs et receveurs.
Limite de la méthode
Cependant cette méthode pourtant extrêmement performante a une faiblesse : elle la tient de sa propre capacité à amplifier l’ADN étranger qui viendrait à la contaminer, faussant alors toute analyse.
Fonctionnement
Pour permettre cette amplification, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant : l’amplification est donc exponentielle.
Une PCR classique se déroule dans un petit tube lui même placé dans un appareil programmable appelé thermocycleur. Le thermocycleur se contente de placer le tube aux températures voulues pendant les durées programmées... et de recommencer en effectuant des cycles. Un cycle reproduit trois températures différentes pendant des durées différentes. La durée d'un cycle est de l'ordre de la minute.
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Pour répliquer cet ADN, l faut donc procéder en trois étapes. Mais avant cela, voyons les acteurs de la PCR.
Avant la réaction, tous les « acteurs » de la PCR sont introduits dans le même tube. Il s'agit de l'ADN à amplifier, des oligonucléotides (ou amorces), spécifiques du segment d'ADN voulu, de l'ADN polymérase (ici la Taq polymérase) et enfin du mélange des quatre désoxyribonucléotides constitutifs de l'ADN. Tous sont ajoutés en large excès par rapport à l'ADN.
Ainsi, l’ADN à amplifié, l’ADN polymérase, des amorces spécifiques et des bases libres (nucléotides) sont nécessaires.
De plus, pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes qui se répèteront de manière cyclique:
Chaque cycle de PCR est consitué de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l'hybridation (ou annelage) et l'élongation (ou extension des amorces).
Les acteurs de la PCR
Les 5’ et 3’ sur les schémas précisent l’orientation de l’élément et ses limites arbitraires.
Les amorces :
Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité servir d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle).
Les oligonucléotides amorces s’hybrident (s’attachent) aux extrémités de la séquence qui va être amplifiée, il faut donc connaître les séquences nucléotidiques des extrémités de la région ADN amplifiée. C'est en effet au niveau de ces extrémités que les oligonucléotides amorces vont s'hybrider. Pour faciliter le choix des séquences des deux amorces, des logiciels d’analyse de séquences permettent de vérifier les points suivants :
- des Températures comparables. Les oligonucléotides amorces doivent s’hybrider à l'ADN matrice dans les mêmes conditions de température,
- des séquences qui ne soient pas complémentaires entre elles (en particulier dans la région 3’),
- des séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de repliement intramoléculaire).
La réactionPendant environ 30 cycles, trois étapes vont se succéder : c’est la réaction de la PCR qui, avec les produits cités ci-dessus, va permettre d’obtenir des milliers de copies de l’ADN sélectionné.
Une fois tous les éléments nécessaires à la réaction regroupés dans le tube soumis à de différentes températures, la réaction pourra commencer :
Les températures de dénaturation et de polymérisation sont fixes, seule la température d’hybridation devra être calculée pour chaque nouvelle PCR. Cette température d’hybridation dépend de la composition en bases des oligonucléotides amorces. Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la température de demi-dénaturation.
Pour calculer le Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation suivante :
Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C) où A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de ces bases dans l’oligonucléotide).
Au fil des cycles la quantité d'amplicons va augmenter de façon exponentielle. On obtient, en théorie 2n copies pour n cycles. Dans la pratique, pour un rendement classique de 85%, une PCR de 30 cycles produit environ 106 copies (amplicons de taille attendue).
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